稻米品種鑑定檢測實驗

100.8.27、8.28、9.3、9.4

這幾年來農試單位沿用相近的親本育種，使水稻品種間的差異逐漸減少，再加上市面上進口食米成本與本地白米售價存有價差，糧商利用進口食米混國產白米銷售，卻在包裝上標示台灣米，以低買高賣從中套利，或有廠商標示「台?9號米」卻魚目混珠(adulteration)整包都不是台?9號米，因此「稻米品種鑑定」日益重要，然而傳統以來「檢查外觀性狀」的技術，由於此些農藝性狀之表現易受環境影響，並不穩定重覆而易誤判，故已無法完全滿足時代的需要。

水稻為全球近50％人口的主要糧食，台大農藝系張孟基老師在「植物分子生物學」研究多年，運用由農委會農糧署在「水稻品種鑑定」研發上多年來之經費贊助及技術開發，終於將驗米的實驗程序在2011年獲得台灣專利（「國內外稻米品種之鑑別方法」970294-I1(97農751)），這次在台大暑期生物技術課程開「水稻品種鑑定檢測實驗課程」，吸引農糧署長官、農改場研究人員、台大學生其中包括「沒有朝醫學發展、不想再殺老鼠」生化科技系學生。

註：張孟基老師「國內外稻米品種之鑑別方法」已取得智財權登記，欲使用者，請連絡menchi@ntu.edu.tw、02-33664771

(請按下圖片,即可放大,張孟基老師真是好老闆,助教名字放在最前面,自己放在最後面)

這門課利用DNA 分子標誌，包括簡單重覆性DNA 序列(SSR) 及單一核?酸多型性(single nucleotide polymorphism, SNP) 等之相關基因定型技術，偵測不同水稻品種間因遺傳組成差異所造成DNA指紋(fingerprinting) 之差別，藉由實際操作，學員可以學習品種鑑識相關技術與知識。

說明一：DNA分子標記(molecular markers)是遺傳標記的一種，可直接於DNA分子層次上檢測物種之遺傳變異。分子標記能對不同發育時期的個體、任何組織器官甚至細胞作檢測，多型性高(多型性是指物種如水稻基因組中，不同個體(基因型)間基因序列產生的主要變異(岐異程度))、遺傳穩定，不受環境限制，應用越來越廣泛。

說明二：簡單重覆性DNA 序列(SSR、Simple Sequence Repeat)是由2至5個不同長度重覆鹼基對構成重複的DNA序列，例如ATAT------AT(AT18) ；CGACGA----CGA (30) (CGA30) 等。可以利用聚合酵素連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR) 以引子(primer) 擴增加以複製，在分析遺傳和育種廣泛地運用。

說明三：單一核?酸多型性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是「DNA序列中的單一鹼基對（base pair）變異」，也就是DNA序列中A、T、C、G的改變，即基因組的一個特異和定位的位點出現不同核?酸可能性，如某X水稻於基因組的特定位置是A；另一Ｙ水稻則是G。是最普遍發生的一種遺傳變異（genetic variation）。

以人類為例，SNP的發生頻率非常之高，且每個人的DNA上所發生的SNP皆不同，故SNP常被當作一種基因標記（genetic marker）用來進行研究。由於SNP的產生可能會造成蛋白質表現的改變，所以SNP會影響人類可能特別容易或不容易染上某些疾病，或對於治療藥物的反應有所差異。

說明四：鹼基有5種：胞嘧啶（縮寫C）、鳥嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T，通常為DNA專有）和尿嘧啶（U，通常為RNA專有）。鹼基位於 DNA 二股上，會互相連結： A-T， C-G配對， 也就是一個嘌磷配一個嘧啶， 稱 "鹼基對" (base pairs)。 

提到稻米品種，張老師先介紹當天中國時報報導「絕種原生香米冰存38年復生， 99年『醫療終身奉獻獎』泰雅族醫師楊茂銀，當年抓把穀子送恩師鍾文政，鍾文政老師擱在冰箱，98年送回這包紀念品，楊茂銀醫師細心育苗存活一芽，今年重新育成銀珠香米成了保脈種源」全文詳http://news.chinatimes.com/focus/11050105/112011082700127.html

左後：實驗助教張靜華小姐、左前實驗助教莊雪玉小姐

進入實驗室，張孟基老師強調詳實記錄「實驗記錄本」對申請專利的重要性。內有許多生化藥品，要穿上實驗衣、戴好手套保護。

水稻基因體由12條染色體組成，共約4億鹼基對，上面記錄著水稻各種生長、繁殖及米質等重要性狀相關的遺傳信息，是研究植物基因體功能最重要的單子葉植物。水稻品種鑑定檢測可以用糙米、白米、甚至稻葉來鑑定，糙米外含糊粉層 (aleurone layer)比起白米可以萃取較多的DNA。

首先將米倒入均分器，自動分成2份，多次進行均分，剩10粒米或隨機取單粒米做為樣本。一般都是檢定這包米有沒有純(稱為定性檢測) 。即是否為宣稱或標示之稻米品種，而無混雜其它食米。米商反應：「一次檢定10粒，若有1粒沒通過，是否代表全部10%的米有問題，2粒沒通過，是否代表全部20%的米有問題？」(僅能判定米有沒有純，是否能判別混雜的比例??)

說明四

定性檢測：檢查這包米有沒有純，可10粒米一起測為粉碎米粉之多粒米法。

定量檢測：每粒單獨測，取代表性，視測定全部樣本米粒中，非鑑定米粒有多少粒？如32粒中有8粒不是，則純度為24/32% = 75%。可能會有假陽性(False Positive)誤判??，誤判真米為假米或假米為真米，因此取樣之均質性，樣品之代表性，樣本米粒數及實驗條件之穩定重覆性皆相當重要。

從如上7個品種，每組分給3個已知品種及1個盲樣，最後要判斷盲樣是那兩種米不同比例之混雜。

將米粒用研缽或均質機研磨成細粉放入離心管，據助教親身經驗，高雄139米質堅硬，最難磨成粉。

每管加入CTAB(一種溴化物、在高鹽下能與DNA結合、低鹽時與DNA脫離)，經過一連串酚及氯